Clostridium perfringens, Bacillaceae familyasına ait Gram pozitif, uçları yuvarlak çubuk şeklinde sporlu, kapsüllü, anaerobik, hareketsiz bir bakteridir. C. perfringens ürettiği toksinler yoluyla gıda zehirlenmelerine yol açar. Ürettiği toksin çeşidine göre A, B, C, D ve E tipi olmak üzere 5 tipi vardır. Bunlardan sadece A tipi toksin üretenler gıda zehirlenmelerine yol açar. C. perfringens gıda zehirlenmesi olaylarının % 95 'i gıdaların pişirildikten sonra yeterince çabuk soğutulmamasından ve ılık olarak bekletilmesinden kaynaklanmaktadır. C. perfringens sporları normal pişirme işlemiyle ölmez. İdeal koşullarda 7 dakika gibi çok kısa bir bölünme hızı ile gıda içerisinde hızla ürer ve zehirlenmeye yol açar. Zehirlenme 6 - 24 saat içerisinde görülür ve 12 - 24 saat kadar sürer.
A tipi toksin üreten suşları insanlarda gazlı kangrene C tipi toksin üreten suşlar ise nadiren nekrotik enteritise sebep olur. Gıda zehirlenmelerinde ise oldukça hafif geçen bir diyareye neden olur ve genel olarak en önemsiz mikrobiyel gıda zehirlenmesine neden olan mikroorganizmalar arasında kabul edilir. Bununla beraber genellikle görülmemekle birlikte, ender olarak çok hassas insanlarda ve yaşlılarda ölüme yol açabilmektedir.
C. perfringens aranmasında standart analiz yöntemlerinde esas olarak alınan canlı hücre sayısıdır. Türk Standartları Enstitüsü (TSE), Uluslararası Standartlar Örgütü (International Standard Organisation ; ISO), ABD Gıda İdaresi (Food and Drug Administration ; FDA) gibi organizasyonların standart metotlarında C. perfringens sayısı için kabul edilebilirlik sınırları belirlenmiştir. Bu standartlarda C. perfringens 'in varlığı veya yokluğunun gösterilmesinin değil canlı hücre sayısının esas alınmasının sebebi doğada çok yaygın olarak bulunması ve ancak yüksek sayılara ulaştıktan sonra insan sağlığını tehdit etmesidir. C. perfringens aranması ve sayımı için daha çok klasik metotlar kullanılmakta olup hızlı analiz teknikleri az sayıdadır.
C. perfringens sporları sıcaklığa dayanıklı olmakla birlikte vejetatif hücreler sıcaklık değişimine karşı oldukça hassastırlar. Bu nedenle örneklerin taşınmasında örneğin tutulacağı sıcaklık derecesi 10 oC' ın altında ve 15 oC' ın üzerinde olmamalıdır. Gıda örneklerinin laboratuvara ulaştırılması 8 saatten daha fazla uzun bir süre alacaksa örnekler tamponlanmış steril gliserin - tuz çözeltisi içerisinde -60 oC' da dondurulmalıdır, bu amaçla kuru buz kullanımı uygun olmaktadır.
Uygun şartlarda laboratuvara getirilen gıda örneğinin katı olması halinde dikkat edilecek diğer bir husus homojenizasyondur. Bu işlemde yüksek hızların kullanılması halinde örnek içerisine fazla hava gireceğinden anaerob olan hücreler zarar görecek ve hücre sayımında gerçekte örnek içerisinde olduğundan daha düşük hücre sayısı bulunacaktır.
C. perfringens aranması ve sayılmasında ön zenginleştirme yapılmamakta, direk olarak selektif besiyerine ekim yapılmaktadır. Bunun nedeni ise C. perfringens içerdiğinden şüphe edilen gıdalarda genellikle hücre sayısının yüksek oranlarda bulunması ve kullanılan temel besiyeri olan Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC)' in oldukça selektif özellikte olmasıdır. Bu besiyeri laboratuvarda hazırlanabileceği gibi ticari olarak hazır halde de bulunmaktadır.
C. perfringens sayımında isteğe bağlı olarak dökme veya yayma kültürel sayım tekniklerinin her ikisi de kullanılabilir.
Dökme kültürel sayım tekniği uygulandığında; ürün sıvı ise deney numunesinden, diğer ürünlerde ise ana dilüsyondan 1 ml alınır ve boş petri kutusuna aktarılır. Petriye 45 oC' da su banyosunda tutulan TSC (SC) agar besiyerinden yaklaşık 15 ml dökülür ve kutu hafifçe karıştırılırılarak besiyeri ile dilüsyonun karışması sağlanır. Besiyeri katılaştıktan sonra aynı besiyerinden petrinin yüzeyini tamamıyla örtecek şekilde 10 ml daha ilave edilir. Katılaşması beklenir ve kapakları üste gelecek şekilde anaerobik kavanozlarda veya anaerobik inkübatörde 35–37 oC 'da 20 ila 24 saat kadar bırakılır.
Yayma kültürel sayım tekniğinde önceden hazırlanmış TSC agar üzerine 0,1 ml örnek veya ana dilüsyon Drigalski spatülü yardımıyla yayılır. Yayılan sıvı absorbe edildikten sonra üzerine tekrar 10 ml TSC agar dökülür. Agarlı besiyeri katılaştıktan sonra anaerobik inkübasyona bırakılır.
İki yöntemde de, inkübasyon süresi sonunda TSC agarda oluşan siyah koloniler muhtemel olarak C. perfringens kolonileridir.
C. perfringens doğrulama deneyleri iki biyokimyasal yöntemle yapılır. Bunlardan birincisi hareket nitrat besiyeri kullanılarak yapılan doğrulama testi, diğeri ise Laktoz Jelatin besiyeri kullanılarak yapılan doğrulama testidir. TSC besiyerinde siyah koloniler meydana getiren C. perfringens hareketsizdir, nitratı nitrite indirger, laktozdan asit ve gaz oluşturur ve 48 saat içinde jelatini sıvılaştırır. Bu sonuçları gösteren bakteriler C. perfringens olarak kabul edilir.
Ancak bu iki biyokimyasal doğrulama testi yapılmadan önce selektif besiyerindeki karakteristik kolonilerin seçilmesi gerekmektedir. Eğer kolonilerin seçimi mümkün olmuyorsa koloniler sıvı Thioglycollate besiyerine aktarılır ve anaerob koşularda 35-37 oC da 18 - 24 saat kadar inkübe edilir. Daha sonra koloniler tekrar TSC agara alınır ve üzerleri 10 ml kadar yine TSC agarla örtülür ve tekrar anaerob inkübasyona bırakılır. Bu işleme siyah karakteristik koloniler seçilebilecek hale gelinceye kadar devam edilir. Seçilen kolonilere yukarıda belirtilen biyokimyasal doğrulama testleri uygulanır.
C. perfringens Aranmasında Hızlı Analiz Yöntemleri
C. perfringens 'in varlığının tespitinde hızlı analiz yöntemleri gıda örneklerinde sık kullanılmamakla birlikte, daha çok tıp alanı için geliştirilmiştir. Buna karşın son yıllarda geliştirilen bazı teknikler gıda örneklerinde de kullanılabilir özelliktedir.
MUP İlave Edilmiş Besiyeri Kullanımı
C. perfringens sayımında son yıllarda geliştirilmiş bir tekniktir. Bu metot TSC Agar besiyerine MUP katılması esasına dayanır. Prensibi MUP’lu besiyerinde üreyen kolonilerin floresans verme özelliğine dayanır.
Hazır Test Kitleri Kullanılarak Yapılan Toksin Analizleri
Son yıllarda ticari firmalarca geliştirilen hazır test preparatları C. perfringens 'e ait 5 tip toksini ayırt edebilme özelliğine sahiptir. Bu kitler direk olarak hücresel bir sayım veya doğrulama tekniği olmamakla beraber gıda örneğinde eğer C. perfringens üremiş ve toksin üretmişse varlığı birkaç saat gibi kısa bir sürede tespit edilebilmektedir. Ancak bu kitlerin kullanılabilmesi için gıda örneğinde mikroorganizmanın bulunması yeterli olmamaktadır. Mikroorganizma ile birlikte, salgıladığı toksinin de gıda içerisinde bulunması gereklidir.
ELISA Tekniği
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay olarak adlandırılan bu teknik daha çok tıbbi laboratuvarlarda kullanılmakla birlikte son yıllarda gıda örneklerinde de uygulanan bir tekniktir. Oldukça yüksek spesifikliğe sahip ve hızlı bir yöntem olmakla birlikte maliyeti oldukça yüksektir uzman bir kullanıcı varlığını gerektirir. Bu nedenle gıda analizlerinde uzmanlaşmış laboratuvarlar dışında pek yaygın olarak kullanılmamaktadır.
Mikrobiyolojik analizler için Diatek tarafından satın alabileceğiniz hazır besiyerlerini güvenle kullanabilirisiniz.