Gıdalarda Protein Tayini ( Kjeldahl Yöntemi )

---

34034 kez okundu

5 yıl önce eklendi

Gıdalarda çok çeşitli amaçlarla protein analizleri yapılmaktadır.

Örneğin;

1. Gıda maddesinin mevcut kalite standartlarına uygunlunun belirlenmesi acıyla: Örneğin; bir çok standartta her bir gıda maddesi için protein oranı, şu standartdan aşağı olamaz gibi kriterler konulmuştur,

2. Gıda maddesinin besleme değerini belirlemek amacıyla: Gıdaların besleme içeriği toplam ham protein miktarının haricinde diğer bazı kalite indeksleri ile de belirlenmektedir, örneğin; PER (Protein EffIciency Ratio), BV (Biological Value), *U (Net Protein Utilization) ve EAO (Esansiyel Amino asit Oranı) gibi,

3. Proteinlerin bazı fonksiyonel özelliklerini belirlemek amacıyla: Örneğin; emülsiyon stabilitesi, emülsiyon kapasitesi, su ve yağ bağlama kapasitesi, köpük oluşturma, jel kuvveti, çözünürlük vb kalite özellikleri ile de proteinler hakkında bilgi edinilir,

4. Proteinlerin bazı teknolojik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla: Örneğin; canda sayılan fonksiyonel özeliklerin gıda işleme açısından uygunluğu,

5. Bir gıda maddesinin genel bileşiminin tespit edilmesi amacıyla,

6. Satışa sunulacak gıda maddesinin fiyatını ayarlamak amacıyla: Genel olarak bir gıdanın proteini ne kadar çoksa, o gıda maddesi de o kadar değerlidir,

7. Herhangi bir işleme tekniğinin proteinler üzerindeki etkisini belirleri amacıyla: Örneğin; sterilizasyon, pastörizasyon,fermantasyon vb işlemlerin g proteinlerine etkisini belirlemek gibi.


Proteinlerde Bulunan Toplam Azotun (N) Dikkate Alındığı Metotlar
Yapılan çalışmalar, gıda içerisinde bulunan N'un % 99'nun proteinlerden Iti saklandığını ortaya koymuştur. Ancak, protein tabiatında olmayan diğer bazı gıda bileşenlerinin de azot ihtiva ettiği bilinmektedir. Bu bileşiklerden bazdan; N'li SEL-Tonhidratlar, lipitler, (lesitin vb) nükleik asitler, pürin bileşikleri, porfirinler, çeşitli pigmentler, serbest amino asitler, peptitler, üre, amonyum tuzlan, amin ve amid bileşikleri ve çeşitli alkaloitler ile NO2 ve NO3 gibi diğer bazı bileşiklerdir. İşte toplam azotun esas alındığı protein tayinlerinde, protein tabiatında olmayan azot da belirlendiği için bu metoda, genellikle ham protein (crude protein) tayini adı verilir. ancak, yukarıda sayılan bu N'li bileşiklerin gıda maddelerindeki miktarlarının çok küçük olduğu bilindiğinden ham protein çoğu zaman gerçek protein oranı gibi değerlendirilmektedir.

Yapılan araştırmalarda proteinlerin yaklaşık % 16'sının N, geri kalan bölümünün K C, H ve O'den ibaret olduğu bulunmuştur (daha öncede ifade edildiği gibi proteinler, çok az miktarda S, P ve Fe gibi başka elementler de ihtiva edebilmektedir). Ancak proteinlerdeki en düşük N oranı; %4.2 ile (3 lipoproteinIer de, en yüksek N oranı ise; %30 ile protaminler de tespit edilmiştir.

Sonuç olarak protein tayininde, önce t-ia içerisindeki N miktarı bulunur ve bu değer bir faktör (100/16=6.25) ile çarpılarak protein miktarı hesaplanır. Ancak, gıda maddelerinin N oranı değişebildiği gibi gıda celisinde bulunan diğer bazı azotlu maddelerin oranı da farklı olabilir. Bu konuda ip ilan araştırmalar sonucu, her bir gıda maddesi için belirli katsayılar belirlenmiştir, örneğin, bazı gıdalar için bu katsayılar (faktörler) şöyledir;

Et, yumurta, fasulye, balık vb gıdalar için; 6.25
Süt ve mamulleri için; 6.38
Hububatlardan, arpa, çavdar, yulaf için; 5.83
Buğday, un vb tahıllar için; 5.70
Jelatin; 5.30
Kabuklu yemişler için ise; 5.30

Yukarıda da görüldüğü gibi bazı gıdalar için belirlenen bu oranların olmasının en önemli nedenleri şunlardır:

1. Gıda içerisindeki N'nin tamamı protein kaynaklı olmayabilir,
2. Protein tabiatında olamayan N'li bileşiklerinin oranlan farklı olabilir,
3. Her proteinin amino asit oranlan, dolayısıyla N miktarları farklıdır,
4. Bir gıdada değişik yapıdaki proteinlerin oranlan farklıdır.

Daha önce de belirtildiği gibi genel olarak 3 değişik yöntemle toplam eleme -azot tayini, dolayısıyla de protein tayini yapılabilmektedir. Bu metotlarla toplan: tayininde, önce gıda içerisindeki azot, elemental N haline veya amonyum tuzlan dönüştürülerek bunların miktarı; titrimetrik, kolorimeirik yöntemler, iyon spesifik elektrotlan veya termal iletkenlik detektörleri ile belirlenir. Daha sonra bulunan miktan, yukarıda verilen faktörlerle çarpılarak analiz edilen örneğin protein on belirlenir. N'nin dikkate alındığı protein tayin yöntemi aşağıda açıklanmıştır.

Yöntem, örnekte organik bileşikler halinde bulunan azotun bir katalizör eşliğinde derişik H2S04 ile yaş yakma işlemi sonucunda indirgenerek amonyum azotu haline dönüştürülmesi ilkesine dayanır. Azot, amonyum azotu haline dönüştürüldükten sonra kuvvetli alkali ortamda damıtılarak açığa çıkan amonyak bir asit içinde tutulur ve titrasyon ile miktarı belirlenir. Titrasyon sonucu yapılan hesaplamayla bulunan azot miktarı bir katsayı ile çarpılarak örnekteki protein miktarı belirlenir. Bu katsayı genellikle 6.25 olup, süt ve ürünlerinde 6.38, tahıl ve ürünlerinde 5.70'dir. Kjeldahl yöntemi ile protein halinde bulunmayan amin, amid ve amonyum gibi azotlu bileşikler de protein gibi belirlendiğinden bazı durumlarda azotlu bileşikler için "ham protein" ifadesi kullanılır.

Kjeldahl yöntemi; yakma, damıtma ve titrasyon aşamalarından meydana gelmektedir. Bu aşamalarda meydana gelen reaksiyonlar şu şekilde gösterilebilir:

Çözeltiler:
1. Derişik H2SO4 = % 98'lik ve d : 1.84 g / cm3
2. Yakma tuzu karışımı (Katalizör)* 100 g azot içermeyen K2S04 , 10 g CuS04. 5H20 ve 1 g toz halindeki selenyum iyice karıştırılır ve gerektiğinde bir havanda dövülerek toz haline getirilir.
3. % 40'lık NaOH çözeltisi* 400 g NaOH damıtık su ile litreye tamamlanır.
4. % 2'iik H3BO3 çözeltisi* 20 g saf borik asit (H3B03) damıtık su ile litreye tamamlanır. Çözünmeyi kolaylaştırmak için gerektiğinde içerik hafifçe ısıtılabilir.
5. 0.1 N H2SO4 çözeltisi* 1 litrelik ölçü balonu yaklaşık yarısına kadar damıtık su ile doldurulur. Üzerine 2.7 mL H2S04 (% 98Tık =1.84 g/cm3) çözeltisinden yavaş yavaş ilave edilip ölçü balonu damıtık su ile çizgisine tamamlanır. Çözeltinin ayarı standart (ayarlı) baz çözeltisi ile yapılır.
6. Metil kırmızısı-bromkresol yeşili indikatörü* 0.02 g metil kırmızısı ve 0.10 g bromkresol yeşili 100 mL % 95'lik etil alkol içerisinde çözülür.

Işlem:
Yakma: 1.0 ± 0.001 g örnek tartılarak yakma tüpüne alınır. Üzerine yaklaşık 6.0 g yakma tuzu karışımı konulur. Daha sonra 15 derişik H2S04 eklenir. Yakma tüpüne derişik H2SO4 ilave edilirken tüp hafifçe eğik tutulup yavaş yavaş döndürülerek, tüpün iç yüzeyine yapışan örnek ve yakma tuzu parçacıklarının tüpün dip kısmına yıkanması sağlanmalıdır.

Bu işlemlerden sonra yakma tüpü aletin yakma setine konur ve önce 200-250°C arasında 15-20 dakika ön yakma yapılır. Bu işlem ile başlangıçta yanmakta olan maddelerin köpürüp taşması engellenmiş olur. Daha sonra sıcaklık 380°C'a getirilerek asıl yakma işlemine geçilir. Asıl yakma işlemi 30-45 dakika sürer ve başlangıçta, siyah olan ortam rengi kahverengine döner. Yakma süresinin sonuna doğru karbonlu parçaların oksitlenmesi ile karışımın rengi berraklaşır ve uçuk sarı ile parlak yeşil arası bir renk alır. Bu yakma işleminin tam anlamıyla bittiğini göstermediği için, karışımın berraklaşmasından sonra yakma işlemine 380°C'de en az 20-30 dakika daha devam edilir.

Damıtma: Damıtma sırasında çıkan amonyağı tutmak için, 300 mL'lik bir erlenmayere 50 mL %2'lik H3BO3 çözeltisi konur. Üzerine 5-6 damla karışık indikatör damlatılır ve erienmayer damıtma cihazının soğutucusunun altına yerleştirilir. Soğutucunun ucu borik çözeltisinin içerisine bir kaç mm girmelidir. Bu hazırlıklardan sonra yakma tüpü damıtma cihazındaki yerine takılır ve üzerine 75 40'lık NaOH çözeltisi eklenerek damıtmaya başlanır. Damıtma işlemine erienmayer içerisindeki toplam hacim yaklaşık 150 mL oluncaya kadar devam edilir.

Titrasyon: Damıtma sırasında çıkan amonyak, erienmayer içerisindeki borik asit ile birleşerek amonyum borat oluşturur. Oluşan amonyum borat miktarı, erienmayer içeriğinin 0.1 N H2SO4 çözeltisi ile titrasyonu sonucunda bulunur. Çözeltinin rengi açık pembe renge dönünce titrasyona son verilir. Bu şekilde ortamda bulunan amonyum borat tekrar borik asite dönüştürülmüş olur.

Not: Yakma aşamasından itibaren, örnek dışında, bütün kimyasal madde ve çözeltiler kullanılarak bir şahit deneme yapılır.

Hesaplama:

% Azot Miktarı (g/100g) = / Ö x 100
% Protein Miktarı = % Azot miktarı x 6.25
Vı = Esas deneme için titrasyonda harcanan 0.1 N H2S04 miktarı (mL)
V2 = Şahit deneme için tıtrasyonda harcanan 0.1 N H2S04 miktarı (mL)
N = Titrasyonda kullanılan H2SO4 çözeltisinin kesin normalitesi
Ö = Örnek miktarı (g)