Mikrobiyoloji uygulamalarında önemli bir yere sahip olan
hızlı yöntemler klinik, gıda ve çevresel örneklerde bulunan patojen
mikroorganizmalar ve onların metabolitlerinin erken tespiti, izolasyonu,
identifikasyonu ve sayımı için yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. İlk olarak
1960’ların ortalarında geliştirilmeye başlayan bu yöntemler, minyatürize
biyokimyasal, immunolojik, genetik ve biyosensör tekniklerini kapsamaktadır.
Minyatürize biyokimyasal identifikasyon yöntemleri 1965 ile
1975 yılları arasında geliştirilmiş, 1975 ile 1985 yılları arasında kalan süre
immunolojik test yöntemlerinin altın çağı olarak adlandırılmıştır. Genetik tanı
yöntemleri ile polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) uygulamaları 1985 ile 1995
yılları arasında gelişim göstermiştir. 1995 yılından günümüze kadar ise
biyosensör ve mikroarray test sistemleri, çeşitli örneklerde bulunan patojen
organizmaların direk tanısı amacıyla geliştirilmiştir. Bu derlemede anlatılan
immunolojik testler, manüel ve otomatik ELISA (Enzyme Linked İmmunosorbant Assay)
testlerini, lateral migrasyon immunoassay, lateks aglütinasyon testlerini ve
immunomanyetik separasyon yöntemlerini kapsamaktadır. Genetik tanı
yöntemlerinden birisi olan PZR, patojen mikroorganizmaların doğru tanısını
güçlendirmek için son yıllarda daha da geliştirilmiştir. Hızlı testlerin
güvenirliği ile ilgili bir çok araştırmanın sonuçları göstermiştir ki; bu
testler ucuz ve hızlıdır ayrıca yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahiptirler. Bu yazıda
hızlı testlerin çalışma prensipleri sunulmuştur.
Mikrobiyolojik yöntemler; geleneksel ve hızlı yöntemler olmak
üzere ikiye ayrılır.
Geleneksel yöntemler halen altın standart olarak kabul
edilmektedir. Hızlı yöntemler terimi, farklı tiplerdeki minyatürize
biyokimyasal kitleri, antikor temelli serolojik testleri, nükleik asit
hibridizasyon kökenli yöntemleri ve biyosensörleri kapsamaktadır. Bu test
yöntemleri manuel, yarı otomatik veya tam otomatik kullanıma sahiptirler.
Hızlı yöntemler; klinik, gıda ve çevresel örneklerde bulunan
bakteri, mantar, virüs ve protozoon gibi mikroorganizmalar ile onlara ait metabolitlerin
izolasyonu, identifikasyonu, erken tanısı, sayımı ve bakterilerin
antibiyotiklere olan duyarlılıklarının belirlenmesinde kullanılmaktadır. Bu
yöntemler yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahip olmalı, ayrıca ucuz ve kısa
sürede sonuç vermelidir. Günümüzdeki yöntemlerin tamamı bu sayılan özellikleri
taşımaktadır.
MİNYATÜRİZE
BİYOKİMYASAL İDENTİFİKASYON YÖNTEMLERİ
Mikroorganizmaların identifikasyonunda kullanılan geleneksel
biyokimyasal testlerde yoğun işgücü ile yüksek miktarda ayıraç ve besiyeri
tüketilmektedir. Minyatürize biyokimyasal yöntemlerde ise dehidrate ayıraçlar
veya kullanıma hazır besiyerleri kullanılmaktadır. Bu teknikler genellikle
“modern biyokimyasal identifikasyon teknikleri” adı ile anılmakta ve günlük
laboratuvar uygulamalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Minyatürize
biyokimyasal yöntemlerde, hazır bulunan çeşitli sıvı veya katı besiyerlerine
saf kültürler inokule edilip inkübe edilir ve enzimsubstrat ilişkisine bağlı
oluşan renk değişimi ya da gaz oluşumu ile bakteri belirlenir. Sonuçlar tanı
çizelgeleri ile karşılaştırılabileceği gibi veritabanları ile de analiz
edilebilir.
Bu yöntemler, önceleri enterik bakterileri (Salmonella,
Shigella, Proteus, Enterobacter vb.) identifiye etmek için tasarlanmışken daha
sonraları fermentatif olmayan bakteriler, Gram pozitifler, anaeroblar ve
mayaların identifikasyon ve antibiyogramlarını yapabilecek şekilde geliştirilmişlerdir.
Bu sistemlerde kullanılan test kartları, değişik büyüklüktedirler ve
antibiyotik veya identifikasyon substratları içeren değişik sayıda mikro
kuyucuklardan oluşmaktadırlar. Plastik kartların her gözünde farklı ayıraçlar
bulunmaktadır. Bilinmeyen kültürün sıvı formu plastik kartların her bir gözünün
vakum dairesinden verilmekte ve kart bir inkübatöre kaldırılarak 4-12 saat
inkübe edilmektedir. Otomatik yöntemlerde, sistem belirli sürelerle her bir
kartı taramakta ve renk değişimi veya gaz oluşumunu her bir göz için veritabanı
ile karşılaştırmaktadır.
İlk karşılaştırmalı analizlerin çoğu klinik örneklerinin
değerlendirilmesine odaklanmıştır. Minyatürize diagnostik sistemlerin
kriterlerinin belirlenmesi amacıyla yapılan ilk çalışmalarda, minyatür
sistemlerin geleneksel yöntemlerden daha hızlı, daha doğru ve daha ucuz
oldukları ve ayrıca insan gücünden ve çalışma alanından tasarruf sağladıkları
sonucuna varılmıştır. Başlangıçta, hızlı tanı kitlerinin her bir gözündeki renk
değişimi gözle okunup daha sonra elde edilen manuel identifikasyon kodu
kullanılarak mikroorganizma belirlenirken, son zamanlarda diagnostik tanı
şirketleri bilinmeyen kültürlerin identifikasyonlarının hızlı ve doğru
yapılabilmesi için bilgisayarlı otomatik okuyucular geliştirmiştirler.
Mikrobiyolojik yöntemlerin minyatürizasyonu, materyal ve
zaman kazancı ile ticari mikrobiyolojiye hızlı ve kolay çalışma imkanı
sağlamıştır. Geliştirilen sistemler ile özellikle rutin teşhis
laboratuvarlarında kısa sürede fazla sayıda örnek işlenebilmektedir. Ayrıca bu
sistemler gelişmiş laboratuvarların çok sayıda kültür işlenmesi gereken
çalışmalarında ve birçok araştırmada kullanılabilmektedir.
İMMUNOLOJİK YÖNTEMLER
Mikroorganizmaların belirlenmesi ve karekterizasyonunda
antikor antijen reaksiyonu yıllardır uygulanmaktadır. Ayrıca, düşük moleküler
ağırlığa sahip mikotoksin, pestisit veya veteriner ilaçları gibi gıda
kontaminantlarının belirlenmesinde de tercih edilmektedir. Bir immunolojik
yöntemin spesifitesini büyük ölçüde kullanılan antikorun spesifitesi
belirlemektedir. İmmunolojik yöntemlerde üç çeşit antikor kullanılmaktadır:
Poliklonal antikorlar, monoklonal antikorlar ve rekombinant antikorlar.
Antijen-antikor reaksiyonu tüm patojenlerin hızlı belirlenmesi için güçlü bir
sistemdir. Bazı sistemler yüksek oranda otomatize edilmişken bazı sistemler ise
basit kullanıma sahiptir. Bu testler şöyle sınıflandırılabilir:
1. Lateks
Aglütinasyon Testleri
Antikor kaplı ve boyalı lateks ya da kolloidal altın
partikülleri, hızlı serolojik identifikasyon ya da saf bakteri kültür
izolatlarının teşhis ve tiplendirilmesinde kullanılır. Antijen ile antikorun
birleşmesi sonucu gözle görülür aglütinasyon şekillenir. Ters lateks
aglütinasyon testleri çözünebilir antijenler içindir ve çoğunlukla toksinlerin
aranmasında kullanılırlar.
2. Otomatik ve Manuel
ELISA (Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay) Yöntemleri
Antijen antikor reaksiyonunu gerçekleştirmek için birçok
yöntem olmasına rağmen son yıllarda en çok kullanılan yöntem ELISA testidir. Bu yöntemde, antijen ya
da antikor bir enzimle işaretlenmekte ve immunolojik reaksiyon, enzimatik bir
aktivite sonucu ölçülmektedir. ELISA testinin direkt, indirekt ve sandviç ELISA
gibi farklı şekilleri olmasına rağmen en sık kullanılanı sandviç ELISA
yöntemidir.
Patojen mikroorganizmaları ve toksinlerini belirlemek için
birçok ELISA testi geliştirilmiştir. Fakat bunun yanında ELISA’nın manuel
prosedürü çok zahmetli olduğu için son zamanlarda bazı ELISA testleri (VIDAS,
Assurance EIA, Transia ElisamaticII, Detex vb) tamamen otomatik hale
getirilmiştir. Bu sistemler ile Listeria, Listeria monocytogenes, Salmonella,
E.coli 0157, stafilakokkal enterotoksin ve Campylobacter gibi patojen ve
toksinleri kısa sürede otomatik olarak teşhis edilmektedir. Günümüzde
kullanılan birçok ELISA kiti yüksek standarda sahiptir ve otomatik olarak
çalıştıkları için hız ve verimi arttırmakta ve insan hatalarını
azaltmaktadırlar.
3. Lateral Migrasyon
İmmunoassay (İmmunokromatografi) Yöntemi
İmmunoloji alanındaki diğer bir gelişme ise antijen-antikor
ilişkisine dayanan “Lateral Flow Teknoloji”sinin kullanımıdır. Bu test
formatında da sandviç prosedürü kullanılır fakat ikinci antikor lateks
partikülleri veya koloidal altın ile bağlanmıştır. Zenginleştirilmiş örnek bir
seri dairelere transfer edilir ve yıkama işlemine gerek yoktur. Bu sistemde,
test kiti üç reaksiyon bölgesine sahiptir. Birinci kuyucuk hedef antijenle
reaksiyona girecek antikorları içerir. Bu antikorlar renk partikülleri ile
bağlanmıştır. Sıvı formdaki örnek (bir gece süreyle zenginleştirilmiş) bu
kuyucuğa eklenir eğer örnekte aranan organizma varsa antikorlarla reaksiyona
girecektir. Oluşan kompleksler kapiller hareket ile ikinci bölgeye lateral
olarak yığılacaktır. İkinci bölge, hedef antijen ile reaksiyona girebilecek
şekilde düzenlenmiş ikinci bir antikor grubu içerir. Eğer aranan mikroorganizma
örnekte varsa oluşan kompleksler bu ikinci antikor grubunca kaplanacaktır ve
birinci antikor grubunun renk partikülleri ile kaplı olmasından dolayı mavi bir
çizgi hattı oluşacaktır. Fazla antikorlar üçüncü bölgeye yığılmaya devam
edeceklerdir. Üçüncü bölge ilk antikorlar ile reaksiyona girebilen diğer bir
üçüncü çeşit antikora sahiptir. Böylece üçüncü bölgede ikinci bir mavi hat
oluşacaktır. Bu çizgiye “kontrol” çizgisi denilmektedir ve sistemin çalıştığını
göstermektedir. Tüm bu prosedürler yalnızca 10 dakikada oluşmaktadır ve gerçek
bir hızlı testtir.
Bacillus anthracis,
E. coli 0157, Salmonella, Listeria ve Avian influenza gibi patojenlerin çeşitli
örneklerden hızlı tespiti ve identifikasyonu için çeşitli testler
geliştirilmiştir. Örnekler 8-24 saatlik zenginleştirmeye tabi tutulduktan sonra
test kutusuna aktarılmaktadır. Sadece kontrol çizgisinin oluşması sonucun
negatif olduğunu, hem kontrol çizgisinin hem de test çizgisinin oluşması
sonucun pozitif olduğunu gösterir.
4. İmmuno-Manyetik
Seperasyon (IMS) Teknolojisi
Bu yöntemde, metalik partikülleri antikorlarla kaplanmakta
ve milyonlarca metalik partikül şüpheli sıvı numuneye eklenmektedir. Örnek bir
saat kadar karıştırıldıktan sonra partiküllerdeki antikorlar antijen ile
bağlanmaktadır. Reaksiyondan sonra tüp manyetik güç kaynağına yerleştirilip
partiküller mıknatısın yardımı ile tüpten uzaklaştırılır. Daha sonra bu metal
partiküller selektif agar, ELISA, PZR ya da diğer mikrobiyolojik yöntemler ile
saf kültür olarak elde edilebilirler. IMS sistem, gıdalardan patojenlerin
belirlenmesinde zenginleştirme ve ön zenginleştirme basamaklarından en az bir
gün tasarruf sağlamaktadır.
Son zamanlarda birçok tanı sistemi (ELISA, PZR vb)
immuno-manyetik kaplama sistemi ile kombine edilmiştir. Bu sayede inkübasyon
süresi kısaltılmış ve duyarlılık arttırılmıştır.
GENETİK YÖNTEMLER
Mikroorganizmaların fenotipik özellikleri üreme şartlarına
bağlıdır. Bu üreme şartlarına örnek olarak, ısı, pH, besin ihtiyacı,
oksidasyon-redüksiyon potansiyeli, çevresel ve kimyasal stresler, toksinler vb.
verilebilir. Bakteri ve hücrelerin genotipik özellikleri ise çok stabildir.
Bakteriyel kültürlerde doğal mutasyon oranı yüz milyonda birdir. Son yıllardaki
gelişmeler genetik testlerde diagnostik mikrobiyoloji içerisinde identifikasyon
ve doğrulayıcı testler olarak kullanılmasını sağlamıştır. Bilinmeyen bir
bakteriye ait DNA dizisinin bilinen bir DNA probu ile hibridizasyonu genetik
testlerin ilk aşamasını oluşturmuştur. Genetrak Sistem (Framingham)
patojenlerin enzimle işaretli DNA probları kullanılarak tespit edilmesi için
geliştirilmiş hassas bir yöntemdir.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), çeşitli örneklerde
bulunan patojen mikroorganizmaların hızlı ve doğru teşhisi için son yıllarda
hızlı bir gelişim göstermiştir. Bu yöntemde, aranan mikroorganizmaya ait hedef
gen bölgesinin kısa oligonükleotid parçaları ile amplifikasyonu yapılmakta ve
çoğaltılan DNA parçaları elektroforez yardımı ile görüntülenmektedir. Bu
yöntemin, çeşitli örneklerde bulunan mikroorganizmaları teşhis etmede, altın
standart olarak kabul edilen kültür yöntemi kadar güvenilir olduğu tespit
edilmiştir. Birçok mikroorganizmanın tespit ve identifikasyonu için çok sayıda
PZR protokolü geliştirilmiştir.
BİYOSENSÖR KÖKENLİ
YÖNTEMLER
Biyosensörler, bünyesinde biyolojik bir duyargacı bulunan ve
bir fizikokimyasal çeviriciyle birleştirilmiş analitik cihazlar olarak
tanımlanmaktadır. Biyosensörlerin amacı, bir veya bir grup analit (analiz
edilecek madde) miktarıyla orantılı olarak sürekli sayısal elektrik sinyali
üretmektir. Biyosensör sistemleri üç temel bileşenden oluşmaktadır. Bunlar;
seçici tanıma mekanizmasına sahip “biyomolekül/ biyoajan”, bu biyoajanın
incelenen maddeyle etkileşmesi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyalleri
elektronik sinyallere dönüştürebilen “çevirici” ve “elektronik” bölümlerdir.
Biyosensörün görevi biyolojik bir olayın elektriksel sinyale dönüştürülmesidir.
Biyosensörler biyokomponentler (reseptör) ile fiziksel komponentlerden
(transdeeuser) oluşurlar. Yapılarında görev alan biyokomponentler çoğu kez
biyoreseptör olarak adlandırılırlar.
Bunların içinde en yaygın kullanılanlar
enzimler ve antikorlardır. Enzim – substrat ve antikor – antijen arasındaki
etkileşimin ilk adımı analitlerin protein moleküllerine bağlanmasıdır.
Biyosensörlerin, klinik, teşhis, tıbbi uygulamalar, süreç denetleme, kalite
kontrol, tarım ve veteriner hekimlik, bakteriyel ve viral teşhis, ilaç üretimi,
endüstriyel atık su denetimi, madencilik, askeri savunma sanayi gibi alanlarda
kullanımı söz konusudur. Biyosensörler, enzim, mikrobiyal, immuno ve DNA–
sensörler olarak gruplandırılabilirler. “Detex” sistem bu alandaki otomatize
edilmiş bir sistem olupelektroimmunoassay biyosensör teknolojisi
kullanılmıştır. Tüm ayıraçlar kullanıma hazır bir şekilde cihazın içinde hazır
bulunmaktadır. Test edilecek örnek test kasetine yerleştirilir ve immunolojik
reaksiyonlar için ayıraç sekansı otomatik olarak başlar. Reaksiyonlar
tamamlanınca sonuç cihaz tarafından rapor edilir.
Hızlı yöntemler, yoğun numune akışının olduğu gıda ve
hastane laboratuvarları başta olmak üzere tüm mikrobiyoloji laboratuvarlarında
yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Özellikle son yıllarda gelişimi ivme
kazanan PZR yöntemi, birçok patojen mikroorganizmanın gen sekanslarının
belirlenmesi ile yaygın bir kullanım alanına kavuşmuştur. Bu yöntemle bir gün
gibi kısa bir süre içerisinde sonuç verilerek zaman tasarrufu da
sağlanmaktadır. Gelecekte, biyosensör çeşitlerinin gelişmesiyle, hızlı tanı
yöntemlerinin özellikle HACCP programları kapsamında kontaminasyon noktalarının
değerlendirilmesinde kullanılacağı beklenmektedir.
Kaynak: Mikrobiyolojide
kullanılan hızlı tanı yöntemleri Rapid diagnostic methods in microbiology Zeki
ARAS, Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji
Dergisi